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WB 高背景主要有兩種情況：黑乎乎一片或者零星雜點。這種背景與轉膜后的各個步驟（如封閉、洗膜、抗體和發光液孵育等）息息相關。以下我將一一揭秘個中緣由，還科研一片綠林。——作者按Western blot 系列：1. 背景喧賓奪主，怎么破？情景一：云里霧里

插圖 1，此處假裝云霧彌漫的 WB 圖原因：a. 封閉不徹底b. 洗膜不徹底c. 試劑（如抗體等）的品質及使用d. 膜變干e. 印記膜被污染解決方案：1. 使用 5% 脫脂奶粉*-TBST* 進行封閉，室溫緩慢搖晃封閉 1 h。BSA 并非合適的封閉試劑，對于磷酸化靶標，也需使用脫脂奶粉封閉。* 脫脂奶粉建議使用實驗級別奶粉（CST 貨號 #9999），不建議使用食品級奶粉。* 熒光 western，則用 TBS。2. 洗膜的徹底程度與洗膜液成分及時間有關。1) 洗膜液成分：鹽離子和 Tween®20 的濃度是關鍵，兩者濃度越高，洗滌越徹底。CST 建議使用 137 mM NaCl，20 mM Tris, 0.1% Tween®20 進行洗膜。(使用 CST #9997, 或者自行配置，配方見文末)2) 洗膜時間：5 min X 3 次。洗膜時，印記膜盡量不要互相重疊，防止洗膜不徹底。3. 儲存已久的緩沖液、配置數天的 5% 脫脂牛奶等，都可能因變質而造成背景升高。此外，實驗材料不應重復利用，如濾紙等。4. 抗體、發光液的品質、使用方法都會造成背景的產生。1) 一抗：1-1) CST：根據抗體說明書提示，使用 5% BSA-TBST 或 5% 脫脂奶粉-TBST 稀釋；1-2) 其他：參考供應商抗體說明書；1-3) 根據說明書，根據合適的推薦倍數稀釋。稀釋倍數過高或抗體品質原因均可造成高背景。2) 二抗與 ECL 液：使用 5% 脫脂奶粉-TBST 稀釋，稀釋倍數參考二抗和 ECL 發光液供應商的說明書，根據 ECL 液靈敏度調整二抗稀釋倍數；

拿 CST 的二抗稀釋比優化方案舉個栗子5. 孵育抗體、洗膜時，使用的液體需足量，防止干膜。孵育時，注意液體流失或搖床斷電等因素。6. 操作時，需全程戴手套，防止手上的油污對印記膜造成污染。情景二：星星點點

插圖 2，此處又雙假裝有星星點點的 WB 圖原因：a. 轉膜后，膜上的殘留凝膠顆粒造成的非特異性結合；b. 奶粉未完全溶解；解決方案：1. 轉膜后，將印記膜在 TBST 中漂洗 5 分鐘，去除殘留凝膠，再進行封閉。CST 使用的 NC 膜（#12369），可在轉膜后使用 TBST 洗滌。如為熒光 western，則使用 TBS。其他生產商的印記膜，可參考供應商說明書選擇合適的轉膜后洗滌液。2. 延長脫脂奶粉與 TBST* 的混勻時間，使脫脂奶粉徹底混勻。 * 如為熒光 western，則為 TBS。3. 封閉后可進行洗膜，TBST 5 min X 3 次。配方贈送10 X TBS ：24.2 g Tris Base，80 g NaCl 加入 800 mL ddH2O 中，混勻；調整 pH 為 7.6；加 ddH2O 定容至 1L。1XTBST：100 mL 10XTBS，加 ddH2O 稀釋至 1L，加入 1 mL Tween®20，混勻。

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