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從 「2018 冷泉港亞洲：癌癥與代謝」 會議林圣彩教授主題報告的演講內容出發，深度整理林教授 AMPK 系列研究重大成果和新發現的研究思路，以期幫助科研工作者能夠借助他山之石，在自己的領域巧耕耘，摘碩果。

圖 1：林圣彩 教授 冷泉港 2018 報告現場

3 月 26 日（本周一）晚，在 「2018 冷泉港亞洲：癌癥與代謝」 會議的主題報告上林圣彩教授帶來了 AMPK 最新的研究成果。林教授系統的介紹了 AMPK 作為糖感受器這一改寫教科書式發現的研究歷程。其通路逐步闡明的故事也為廣大科研工作者提供了很好的參照。

作為林教授的 「粉絲」，此次有幸在現場聽到了林教授風趣的演講和研究歷程的故事，小編將林教授的分享再結合其科學發現和研究思路整理如下，希望能給大家帶來一點啟發。一隅之見，如有謬誤，望不吝賜教。

1 研究戰略：圍點打援，深挖洞，廣積糧

近 20 年來 [1]，林教授課題組一直都在持續關注 Axin 蛋白相關分子及其作用機制。

Axin 是多結構域支架蛋白，能與 APC、GSK-3β、PPA2 和 β-catenin 等蛋白相互作用形成復合物，是 Wnt 信號通路中的關鍵負調控因子。

林教授課題組早年就發現除了在 Wnt 信號通路的經典作用，Axin 作為支架蛋白在 JNK 信號通路中也起到了多重作用 [2]。從相互作用蛋白入手闡明了整個信號通路的分子機理及生物學功能。此后又進一步研究 Axin 同 p53 的關系與作用 [3-4]，及其在 TGFβ 信號通路中的功能和機制 [5]。將 Axin 的生物學意義在發育分化、細胞生長、凋亡、腫瘤研究領域進行了深入挖掘，產生了系列研究成果。

隨后林教授課題組又逐漸將研究的目光轉向細胞代謝相關的信號通路，并在 AMPK 的研究中取得了修改經典教科書級別的發現。林教授在同一個蛋白上深度挖掘，從一條通路擴展到相關的多條信號通路，進而又涉及到了不同學科領域，闡述跟同一個蛋白相關的其他通路的功能新發現，并能夠持續的高水平產出。這除了需要能夠洞見 Axin 這樣蛋白的多通路橋梁作用的戰略眼光之外，還需要課題組有成熟完備的技術平臺和辛勤努力的科研人員。

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如何修煉自己的戰略眼光？首先需要對經典通路的關鍵節點及其上下游有充分的理解，CST 通路幫您搭建信號通路、蛋白相互作用的既微小又宏大的世界觀：

圖 2：經典的 WNT 信號通路中 Axin 起到關鍵調節作用。

2 「跨界分子」 AXIN 的再次升華：在 AMPK-LKB1 互作機制中的功能，明確其代謝通路地位

作為細胞能量感受器，AMPK 可對 AMP：ATP 比值升高做出反應。在其激活后，可對補充細胞 ATP 供應的信號轉導通路做出正向調控，這些通路包括脂肪酸氧化和自噬。AMPK 對消耗 ATP 的生物合成過程具有負向調控作用，包括糖異生、脂質和蛋白質合成。林教授風趣而又貼切的將 AMPK 比喻為細胞感知 「貧窮」 狀態的關鍵蛋白。

AMPK 作為異源三聚體復合體出現，內含一個催化性 α 亞單位和調節性 β 和 γ 亞單位。AMP 結合到 γ 亞單位后，可變構激活復合體，使其變為蘇氨酸 172（T172）位點更易磷酸化的底物，在 α 亞單位的激活環中更易被主要的上游 AMPK 激酶 LKB1 磷酸化。因此 pAMPKα（T172）被 LKB1 磷酸化被看做是 AMPK 通路激活的標志。

從 2013 年的 Cell Metab 文章開始 [6]，林教授課題組開始將 AXIN 的研究拓展到了 AMPK 信號通路，首次報道發現了 AXIN-AMPK-LKB1 復合物相互作用的現象，確立 AXIN 在 AMPK 通路中的作用。其研究思路簡單總結如下（詳細請見文末參考文獻原文）：

Figure 1, 2 多模型現象闡述：AXIN 對 AMPK 激活和脂質穩態調節起到關鍵作用。

方法：小鼠及不同細胞模型中（包括禁食和葡萄糖饑餓），siAXIN 后檢測不同狀態下的 AMPK 激活情況，及成脂代謝指標。

所用技術：WB、生化檢測、mRNA 檢測、IF、成脂染色、siRNA。

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檢測指標的篩選在表型研究中至關重要，CST 推出了很多小包裝抗體試劑盒，幫助大家多快好省初篩通路蛋白，以本文涉及到的 AMPK 相關的脂代謝領域為例：

表：CST 的 AMPK 相關的脂代謝領域小包裝抗體試劑盒。點擊查看用于靶點篩選的小包裝抗體試劑盒。

圖 3：AXIN-AMPK-LKB1 相互作用現象闡述和機制證明，及作用模式圖 [6]。

此文證明了 AXIN 是一個橋梁，不僅在經典的 Wnt 通路中起作用，而且也 「意外發現」 其將 AMPK 和其上游激酶 LKB1 連接在一起 [7]。此三者形成一個復合體，促進 LKB1 對 AMPK 的磷酸化激活，使得 AMPK 的活性升高，從而完成信號傳遞過程。當時這篇文章認為 AMP 在其中起到最關鍵的作用，而尚未明確此文中采取的糖饑餓這種刺激因素實際上也能成為 AMPK 還是糖感受器的一個證據，也為后面更升華的研究埋下伏筆。

3 「順藤摸瓜」 發現 v-ATPase - Ragulator 復合物是代謝控制的中心：可調節 mTORC 和 AMPK 的開關

AMPK 之外，mTOR 也是細胞代謝通路的一條主要通路。mTORC1 是重要的生長調節因子，能夠控制調節脂質合成代謝、增殖、蛋白翻譯合成等一系列合成代謝途徑。相對 「貧窮」 感知者：分解代謝通路的 AMPK，林教授將合成代謝通路的 mTOR 比喻為細胞感知 「富足」 狀態的關鍵分子。

小分子 GTP 酶 Rheb，在與 GTP 結合的狀態下，是 mTORC1 激酶活性所需的強效刺激劑，并且受到其 GAP（即 TSC1/2）的負性調控。在經典通路中，絕大多數上游輸入信號通過 Akt 和 TSC1/2 來調節 Rheb 的核苷酸負載狀態，AMPK 對 mTORC1 的負調控也不例外。

與這種通過 「PI3K/Akt – TSC 復合物- Rheb」 軸的中心調控方式相對應的，氨基酸信號以獨立于軸的方式將信號指向 mTORC1 ，并促進 mTORC1 轉運到溶酶體表面，在溶酶體可與 Rheb 接觸并激活。這一過程由多種復合體的協調行動來介導，主要包括 v-ATPase – Ragulator - Rag。 Rag 是一類 GTPase，由 A、B、C、D 四個成員組成，Rag A/B 的 GTP 結合形式能將 mTORC1 轉位到內涵體表面。Ragulator 復合物是由 LAMTOR 1/2/3/4/5 組成的五聚物，能將 Rag 定位到內涵體膜，并且可以作為其鳥苷酸交換因子（GEF）。V-ATPase 能夠感受能量和營養狀態，刺激 Ragulator 的 GEF 活性，進而使得 Rag A/B 由 GDP 結合形式轉化為 GTP 結合形式，從而增加 Rag 同 mTORC1 的親和力，最終導致 mTORC1 轉位到溶酶體表面 [8]。

那么，在經典的 「TSC 復合物- Rheb」 軸之外，是否還存在 AMPK 對 mTOR 調控的另外作用機制？在不同能量和營養狀態下這兩條經典的通路如何對話？林教授課題組 2014 年發表的論文給出了證明：溶酶體 v-ATPase - Ragulator 復合物是 AMPK 和 mTORC1 的共同激活因子，是合成代謝和分解代謝的重要開關 [8]。其研究思路簡單總結如下（詳細請見文末參考文獻原文）：

Figure 1 明確第一主角和前文關聯： LAMTOR1 在 AXIN 激活 AMPK 作用中是必須的。

方法：用 siAXIN 證明 LAMTOR1 和 AXIN 有互作；肝臟特異性敲除、肌肉特異性敲除 LAMTOR1 小鼠中，檢測 AMPK 活性和下游功能；LAMTOR1 敲除原代細胞或 RNAi 模型中檢測 AMPK 在糖饑餓、不同激動劑下的作用。

所用技術：coIP，WB、生化檢測、siRNA。

Figure 2 第一主角調控細節闡明：葡萄糖饑餓介導 Ragulator-AXIN/LKB1-AMPK 復合物在內涵體形成。

方法：細胞和動物模型中，結合條件性敲除，siRNA 證明蛋白互作和共定位。找到點突變，補充證明互作重要性。找到干預晚期內涵體的指標，進一步證明內涵體定位的重要性。

所用技術：coIP、Pulldown、WB、密度梯度分離、IF、siRNA、激酶活性檢測。

Figure 3 做實調控功能，確實是全新發現的通路：LAMTOR1 降低 pAMPK 激活所需的 AMP 濃度閾值。

方法：LAMTOR1 敲除模型中檢測 AMP 不同濃度作用下的 AMPK 激活。關鍵活性位點的點突變、激活劑、通路上下游檢測等方法，排除經典作用通路，說明 LAMTOR 對 AMPK 的激活為全新通路。

所用技術：WB、點突變。

Figure 4 進一步鏈接框架，印證新穎性：AXIN 在 LKB1 轉位至內涵體過程中起到支架蛋白的作用。

方法：敲低 AXIN 的情況下做 LAMTOR1 和 AMPK、mTORC1 復合物的互作、共定位。梯度離心印證細胞亞定位。并排除 AMPKa 自身及 TSC 復合物經典通路在定位和互作中的主要作用，進一步印證本研究的新穎性。

所用技術：coIP、IF、WB、密度梯度分離。

Figure 5 再點出第二主角：v-ATPase 和 Ragulator 共同扮演主要感受器促使 AXIN/LKB1 的轉位

方法：將 v-ATPase 拉入互作證明體系。配合體外結合、激動劑處理實驗驗證。

所用技術：coIP、IF、WB、密度梯度分離、siRNA。

Figure 6 第二主角的功能和機制再明確：AXIN 在 v-ATPase 抑制導致的 mTOR 從內涵體解離中起到協助作用

方法：敲低 AXIN、敲低 AMPK、突變 AXIN 上 LAMTOR 結合位點等的情況下做 AMPK、mTORC1 復合物、vATPase 互作和功能改變。

所用技術：coIP、IF、WB、密度梯度分離。

Figure 7 鏈接到經典通路的功能中，完善整體機制： AXIN 抑制 Ragulator 對 Rags 的 GEF 活性，補上機制作用鏈條的最后一環節

方法：敲低 AXIN、缺失突變 AXIN、敲低 LAMTOR1 的情況下看復合物成分的變化。并檢測 GTP 結合形式 Rag 的變化，證明 AXIN 對 mTORC1 轉位激活復合物的抑制作用機制。

所用技術：WB、coIP、Pulldown、GEF 活性檢測。

圖 5：溶酶體 v-ATPase- Ragulator 復合物是 AMPK 和 mTORC1 的共同激活因子，是合成代謝和分解代謝的重要開關機制證明，及作用模式圖 [8]。

此研究的重要意義在于經典的兩大細胞代謝通路由于 AXIN - V-ATPase– Ragulator-Rag 互作復合物的存在，在溶酶體上關聯到了一起。發現了一條區別于經典 AMPK-mTOR 調控模式的新途徑。以 mTOR 為代表的合成代謝途徑和以 AMPK 為代表的分解代謝途徑，實際上有著之前為人不知的更廣泛的聯系和密切相互作用 [7]。這也為代謝穩態的分子機制探索和相關藥物作用機理的發現和開發提供了重大依據。

「萬能神藥」 二甲雙胍作用機制的揭示就提供了一個有力證明。林教授課題組的進一步研究還發現了二甲雙胍能通過 V-ATPase – Ragulator，作用于 AXIN-LKB1，最終激活 AMPK 并抑制 mTORC，為揭示經典藥物的藥理機制提供了重要參考 [9]。

4 打通 「任督二脈」：AMPK 感知葡萄糖的全新方式被發現

在發現了 AXIN 能在 AMPK 通路中起作用，并且接著又證明 AMPK 和 mTOR 兩條通路焦點控制開關的 V-ATPase – Ragulator 之后。上面實驗的處理組：葡萄糖饑餓和 AMP 處理激活同時采用，似乎總是會引發一個問題：葡萄糖剝奪激活 AMPK，是否僅通過 AMP 的變化發生？

于是林教授課題組又做了大量工作，發現 AMPK 對于葡萄糖的感知是通過前所未知的途徑進行的：果糖 1,6-二磷酸（FBP）和醛縮酶（ALDO）可以介導 AMPK 感知葡萄糖 [10]。其研究思路簡單總結如下（詳細請見文末參考文獻原文）：

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本文涉及的糖酵解過程中間化合物和酶較多，可以利用通路圖幫助回憶這些分子的關系。

圖 6：經典的 Warburg 效應信號通路，展現糖酵解關鍵節點。點擊查看 Warburg 效應信號通路的簡介和熱門靶點抗體產品。

Figure 1 現象闡述，揭示新機制：葡萄糖饑餓激活 AMPK 不依賴于 AMP/ADP

方法：葡萄糖梯度下 AMPK 活性變化，和 AMP/ADP 的比值變化。糖和氨基酸缺失培養基作用不同時間下的 AMPK 活性變化。及伴隨的 AMP/ADP 比值變化。

所用技術：激酶活性檢測、LC-MS。

Figure 2 做實表型的新通路：葡萄糖饑餓激活 AMPK 依賴于溶酶體途徑，排除能量應激效應

方法：糖和氨基酸缺失培養基作用不同時間下的 AMPK 的活性變化時， AMPK 相關蛋白的激活情況。點突變關鍵蛋白 AMPKβ2 的關鍵點 G2A，證實豆蔻?；嚓P的溶酶體機制的關鍵作用。并排除通過其他途徑的信號傳遞可能性。

所用技術：激酶活性檢測、WB、點突變、CRISPR-Cas9。

Figure 3 篩到關鍵代謝物：FBP 缺失是饑餓激活 AMPK 的關鍵代謝物信號

方法：上游 HK 酶 RNAi 之后的檢查糖刺激下的 AMPK 通路。并利用體外重構體系的對比操控，篩查驗證關鍵化合物節點。然后再利用不同細胞模型直接驗證。

所用技術：siRNA、coIP、WB。

Figure 4 找到與關鍵代謝物互作的關鍵酶，補全機制：ALDO 是 FBP 作用于葡萄糖饑餓激活 AMPK 信號的物理連接點

方法： ALDO-TKD（A，B，C 三者同時敲除）后 AMPK 的激活情況檢查。合并 AXIN 敲除。點突變 ALDOA 后檢查證明關鍵結合位點情況。

所用技術：siRNA、coIP、WB、Pulldown。

圖 7：果糖 1,6-二磷酸（FBP）和醛縮酶（ALDO）可以介導 AMPK 感知葡萄糖，及作用模式圖 [10]。

雖然這里只按照論文的正圖主線講解了行文的邏輯，但是背后大量的工作和嚴謹的論證，讓我充分信服 AMPK 作為糖感受器的堅實分子基礎。這篇文章顛覆了傳統認為的：AMPK 需要依賴于 AMP 結合才能活化的認知。研究也開創了醛縮酶以及糖酵途徑成為 AMPK 調節新途徑，以及 AMPK 可以作為糖感受器調控代謝過程的新認知 [10]。

文章還側面印證了 AMPK 作為能量感受器和糖感受器的雙重功能。這也是在急性葡萄糖饑餓期間，細胞 AMP：ATP 能量供給能維持不變現象的分子基礎。首先 AMPK 作為葡萄糖傳感器，其次作為監測能量狀態 AMP：ATP 的傳感器。AMPK 的雙重功能能夠獨立運作，也會彼此增強 [11]。這種能量和糖的穩定對于細胞正常的生理功能穩態的維持起到重要作用。

5 未完待續

林教授在主題報告上回顧了這一系列 AMPK 新機制和通路研究的歷程。在這里我將林教授已發表的 AMPK 相關研究論文選取主線三篇淺析如上，希望借林教授的科學思維、嚴謹論證和研究思路設計方法多少能給大家帶來啟發。如有謬誤，或重點遺漏，望各位大神在評論區賜教。

另外，林教授在主題報告上還透露了 AMPK 相關的研究又有新的進展，涉及到 ER 和鈣離子信號。但由于具體機制尚未詳述。我們只能期待林教授的大作能夠盡快付梓，幫助理解更多 AMPK 通路相關的機制，進而幫助人們在腫瘤、代謝病等領域找到更多的可能靶點，為人類的健康大業添磚加瓦！

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圖 8：經典的磷脂酶信號轉導相互作用通路，展現 ER 鈣流的影響因素。點擊查看鈣信號轉導的簡介和熱門靶點抗體產品。

參考文獻 Reference

1. Zhang, Y., et al., J BiolChem, 1999. 274(49): p. 35247-54.

2. Rui, Y., et al., Dev Cell,2007. 13(2): p. 268-82.

3. Li, Q., et al., Cancer Res,2007. 67(1): p. 66-74.

4. Li, Q., et al., Oncogene,2011. 30(10): p. 1194-204.

5. Liu, W., et al., EMBO J,2006. 25(8): p. 1646-58.

6. Zhang, Y.L., et al., CellMetab, 2013. 18(4): p. 546-55.

7. Hardie, D.G., et al.,F1000Res, 2017. 6: p. 1724.

8. Zhang, C.S., et al., CellMetab, 2014. 20(3): p. 526-40.

9. Zhang, C.S., et al., CellMetab, 2016. 24(4): p. 521-522.

10. Zhang, C.S., et al., Nature,2017. 548(7665): p. 112-116.

11. Lin, S.C., et al., Cell Metab,2018. 27(2): p. 299-313

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